Antonín Leopold Dvořák naît le 8 septembre 1841 à Nelahozeves à 30 kilomètres au nord de Prague en Bohême (actuelle République tchèque). Son prénom est parfois orthographié en français « Anton » dans une forme germanisée. 

Antonín Dvořák quitte l'école à 11 ans pour apprendre le métier de son père, boucher du village, et celui d'aubergiste. Ses parents se rendent compte assez tôt des capacités musicales de leur fils et l’envoient en 1853 chez un oncle de Zlonice, où il apprend l’allemand, la langue officielle de l’administration impériale autrichienne, et améliore la culture musicale qu’il avait acquise avec l'orchestre du village.

Il poursuit ses études à Česká Kamenice et il est accepté en 1857 à l’école d’orgue de Prague, où il reste jusqu’en 1859. Diplômé et lauréat d'un Second prix, il rejoint la Prager Kapelle de Karel Komzák, un orchestre de variétés, où il tient la partie d’alto. En 1862, la Prager Kapelle est intégrée au nouvel orchestre du Théâtre provisoire de Prague, ainsi nommé dans l’attente de la fondation d'un véritable opéra — le Théâtre national de Prague verra le jour en 1881, mais il devra être une nouvelle fois inauguré en 1883 à la suite d’un incendie.

Son expérience de musicien d’orchestre lui permet de découvrir de l'intérieur un vaste répertoire classique et contemporain. Il joue sous la baguette de Bedřich Smetana, Richard Wagner, Mili Balakirev… et trouve le temps de composer des œuvres ambitieuses, dont deux premières symphonies en 1865.

Dvořák démissionne de l’orchestre en 1871 pour se consacrer à la composition. Il vit des leçons particulières qu'il donne, avant d’obtenir un poste d’organiste à l’église Saint-Adalbert (1874).

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Dvořák tombe amoureux d'une de ses élèves, Josefina Čermáková. Il écrit un cycle de chansons, « Les Cyprès », pour tenter de conquérir son cœur. Cependant elle épouse un autre homme, et en 1873 Dvořák épouse Anna, la sœur de cette Josefina. De cette union naissent neuf enfants.

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Alors qu’il obtient ses premiers succès locaux (cantate Hymnus en 1873 sous la direction de son ami Karel Bendl), un jury viennois reconnaît la qualité de ses compositions et lui octroie une bourse, qui sera renouvelée cinq années consécutives. Cela lui permet d’entrer en contact avec Johannes Brahms, qui deviendra son ami et le présentera à son éditeur Fritz Simrock. D’autres musiciens illustres comme les chefs d’orchestre Hans von Bülow et Hans Richter, les violonistes Joseph Joachim et Joseph Hellmesberger, et plus tard le Quatuor Tchèque, auront fait beaucoup pour la diffusion de sa musique.

Son Stabat Mater, les Danses slaves et diverses œuvres symphoniques, vocales ou de musique de chambre le rendent célèbre. L’Angleterre le plébiscite. Dvořák s'y rendra à neuf reprises pour diriger ses œuvres, notamment ses cantates et oratorios très appréciés du public britannique. La Russie, à l'initiative de Piotr Ilitch Tchaïkovski, le réclame à son tour. Le compositeur tchèque fera une tournée à Moscou et à Saint-Pétersbourg (mars 1890).

Célèbre dans tout le monde musical, il est nommé de 1892 à 1895 directeur du Conservatoire national de New York, sur une invitation de sa fondatrice Mrs. Thurber. Il y tient une classe de composition. Sa première œuvre composée aux États-Unis, est la 9e symphonie dite « La Symphonie du Nouveau Monde ». Son succès est foudroyant et jamais ne se dément depuis la première audition le 16 décembre 1893. Une juste reconnaissance qui masque pourtant la beauté et l’originalité des autres symphonies de maturité. Son intérêt pour la musique noire soulève une très vive controverse, dont on perçoit l’écho sur le Vieux Continent. Son séjour en Amérique du Nord voit naître d’autres compositions très populaires, comme le 12e Quatuor (dans lequel il emploie des procédés caractéristiques du blues) et le célèbre 2e Concerto pour violoncelle, qui sera terminé sur le sol européen.

De retour en Bohême, où il retrouve sa douce vie à la campagne, il compose plusieurs poèmes symphoniques : L’Ondin, La Sorcière de midi, Le Rouet d’or, Le Pigeon des bois, inspirés par les légendes mises en vers par Karel Jaromír Erben. Dvořák renouvelle le genre en inventant un procédé de narration musicale fondé sur la prosodie de la langue parlée. Ce procédé dit des « intonations » sera repris par Leoš Janáček.

La fin de sa vie est surtout consacrée à la composition d’opéras dont le plus célèbre reste Rusalka, créé en 1901. Pendant cette période, il dirige également le Conservatoire de Prague.

Antonín Dvořák meurt le 1er mai 1904. Il est enterré comme Smetana au cimetière de Vyšehrad, sur une colline dominant la ville de Prague.

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